母乳是婴幼儿最理想的食物,提供婴幼儿存活、生长和发育所必需的能量、各种营养素和生物活性成分。母乳中蛋白质可以分为清蛋白、酪蛋白和粘蛋白。乳清蛋白包括α-乳白蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、补体、骨桥蛋白等多种蛋白质组分。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种高度磷酸化的酸性糖蛋白。由于最初在成骨细胞中发现该蛋白，其具有骨基质矿化的连接功能而得名[1]。随后研究发现骨桥蛋白存在于多种组织和体液中，在母乳、血浆和尿液中均可以检测到，以母乳中含量最高[2]。母乳中骨桥蛋白约占总蛋白含量的5%～10%[3]。OPN分为细胞内OPN(iOPN)和分泌型OPN(sOPN)，iOPN存在于免疫细胞中，sOPN存在于体液中[4]。它们由相同的mRNA产生，但介导的生物学结果不同[5]。通过翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和蛋白水解加工，不同器官或组织的OPN往往呈现出不同的生物学功能[6]。不同的OPN亚型对髓样细胞群与淋巴样细胞群的调节不同，sOPN和iOPN分别通过促进淋巴细胞数量增加和抑制髓系细胞的产生，协调两种细胞群的平衡，防止自身免疫疾病发生[7]。OPN存在RGD（Arg-Gly-Asp）序列、SVVYGLR序列、钙离子结合位点等，通过与细胞膜表面的多种整合素、钙离子、CD44等受体结合，启动和调节骨矿化、骨重塑、细胞粘附和迁移以及免疫调节等过程[8]。本文描述了母乳中骨桥蛋白的结构、功能、分析方法和含量。

 

　　1.人乳OPN的结构

 

　　人乳OPN由298个氨基酸组成，包含34个磷酸化丝氨酸、2个磷酸化苏氨酸和5个O-糖基化苏氨酸[9]。牛乳含有262个氨基酸，其氨基酸序列和人乳OPN相比，相似性约为61%，缺乏母乳OPN188～209氨基酸序列。在母乳OPN的36个磷酸化氨基酸中,乳腺酪蛋白激酶（casein kinase，MGCK）磷酸化其中29个氨基酸位点；酪蛋白激酶II（CKII）磷酸化6个氨基酸位点。糖基化区域和RGD(Arg-Gly-Asp)整合素结合序列的区域不含磷酸化氨基酸。母乳OPN磷酸化程度显著高于矿化组织如骨OPN，且略高于牛乳OPN（含28个磷酸基团）。母乳OPN富含苏氨酸的区域（残基118～139）均匀分布6个苏氨酸（Thr118、Thr122、Thr127、Thr131、Thr136和Thr139），其中除Thr139外的苏氨酸都是O-糖基化的[10]，牛乳OPN含有3个O-糖基化苏氨酸（Thr115、Thr124和Thr129）。在母乳和牛乳中，OPN很容易发生接近RGD序列和SVVYGLR序列的蛋白质水解，因此大部分乳液OPN呈裂解后的片段形式存在。

 

　　OPN由单个拷贝基因编码，在转录过程中人类OPN可以进行选择性剪接，产生2个剪接变体，每个剪接变体缺少一个外显子，这3种亚型分别是全长异构体（OPNa）、缺乏第5外显子的异构体（OPNb）和缺少第4外显子的异构体（OPNc），在母乳和牛乳中只检测到全长异构体OPNa[11]。

 

　　牛乳和母乳OPN的氨基酸序列和磷酸化、糖基化模式相似，并且两者O-糖基化苏氨酸均位于接近RGD序列的未磷酸化区域，因此表现出相似的体外生物活性[10]。例如，O-糖基化位点在细胞粘附活性中起作用，高浓度磷酸化和酸性氨基酸的区域构成与矿物质（如钙盐）的潜在结合位点。研究显示母乳OPN浓度约为48～266 mg/L，远高于牛乳（约18 mg/L）和婴儿配方奶粉（约9 mg/L）[12]，建议在婴儿配方奶粉中添加牛乳OPN来缩小其与母乳的浓度差距[13]。

 

　　2.人乳OPN的功能

 

　　OPN完整蛋白、OPN片段和OPN肽可通过与多种靶器官受体结合发挥不同功能，包括促进免疫系统成熟、肠道和认知发育等。

 

　　2.1免疫功能

 

　　OPN是诱导辅助型T1（Th1）细胞免疫的关键分子，通过诱导Th1分泌细胞因子白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）促进Th1反应发挥免疫功能[14]。产生Th1反应对于清除细胞内病原体至关重要，OPN敲除小鼠Th1反应有缺陷，相比于野生型小鼠更容易受到单纯疱疹病毒、单核细胞增生李斯特菌和轮状病毒感染[15]。此外，许多研究表明母乳喂养具有预防轮状病毒感染的效果，其中母乳OPN可能是原因之一[16]。OPN可以通过RGD(Arg-Gly-Asp)整合素结合序列与多种不同的整合素结合，可竞争性抑制腺病毒RGD序列在靶细胞av整合素附着[17]。NAGATOMO等[18]通过cDNA基因芯片分析发现，在母乳240个细胞因子相关基因中，OPN基因的表达位居前列。同时免疫组化染色显示，OPN的主要来源是乳腺上皮细胞和乳汁巨噬细胞/单核细胞。这些结果表明，OPN在母乳中大量分泌，并可能在母乳喂养婴儿的免疫发育中发挥潜在作用。

 

　　LÖNNERDAL等[19]开展的随机对照试验观察了喂哺含有不同水平牛乳OPN（0、65和130 mg/L）的配方奶粉与母乳喂养相比，对0～6月龄婴儿生长发育、铁营养状况、健康状况和细胞因子表达的影响。结果显示添加不同水平牛乳OPN婴儿配方奶粉喂养与母乳喂养的婴儿生长、铁营养状况相似，且这两组婴儿间发热天数无统计学差异，但均明显少于未添加OPN配方奶粉喂养的婴儿。添加OPN配方奶粉喂养婴儿血清中的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）浓度与母乳喂养婴儿相似，均明显低于未添加OPN配方奶粉喂养婴儿，这可能是因为OPN通过下调TNF-a水平从而减少炎症信号。此外，母乳及OPN配方奶粉喂养婴儿体内发现较高浓度的IL-12和IL-15，这两种细胞因子由天然免疫细胞产生，是宿主防御细菌和病毒感染的关键介质。基于MetaCore功能分析[20]，母乳喂养或添加65 mg/L OPN配方奶粉喂养婴儿通过上调细胞增殖及细胞粘附途径，促进免疫细胞的产生和成熟。而母乳喂养和添加130 mg/L OPN配方奶粉喂养婴儿外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC)表达更多与免疫球蛋白合成及受体相关的基因，其中包括与儿童过敏风险相关基因。因此添加OPN婴儿配方奶粉改变了婴儿PBMC基因的表达，使其接近母乳喂养的婴儿，改善婴儿免疫发育。母乳中OPN能够抵抗新生儿胃液的消化[21]，并到达肠道免疫细胞，诱导其Th1中细胞因子IL-12表达，从而发挥肠道免疫作用[12]。

 

　　2.2肠道发育

 

　　添加OPN配方奶粉与对照配方奶粉相比，早产仔猪模型的坏死性小肠结肠炎严重程度较低，饲喂富含OPN配方奶粉具有减少腹泻和刺激肠上皮细胞增殖的作用[22]。用添加125 mg/L OPN配方奶粉喂养新生恒河猴3个月，其与母乳喂养组恒河猴空肠转录组基因表达更接近，仅有217个基因差异显著，而母乳喂养组和对照配方奶粉组之间有1017个基因差异表达；此外，OPN通过与整合素受体结合，调节肠道细胞增殖、迁移和趋化[23]。利用母乳OPN、重组母乳OPN和牛乳OPN处理人肠上皮细胞(human intestinal epithelial cell，HIEC)，3种OPN均显著刺激HIEC增殖，基因芯片分析结果显示，与增殖和免疫功能紧密相关的基因如有丝分裂原激活的蛋白激酶13（mitogen-activated protein kinase 13，MAPK13）和细胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）基因等被母乳OPN显著修饰，其中部分基因受重组母乳OPN或牛乳OPN的影响[24]。

 

　　此外OPN还可与乳铁蛋白形成强大的静电复合物[25]，每个OPN分子能够结合3分子乳铁蛋白从而有助于保护乳铁蛋白免受蛋白水解，保持其在肠道中的生物活性，并帮助其运输到肠黏膜的特定部位。同时，两者形成的复合物抵抗消化能力更强，能更有效地被HIEC细胞摄取、结合从而促进肠道细胞的增殖和分化[26]。

 

　　2.3认知发育

 

　　母乳OPN被肠上皮细胞部分吸收，进入循环系统，输送至大脑，提高大脑内OPN水平，从而促进中枢神经髓鞘形成。OPN在大脑中大量表达，并被认为在大脑发育中起作用[4]。母乳中存在高浓度OPN，小鼠乳腺也可表达并分泌OPN。Jiang等[27]建立了OPN小鼠模型，用野生型母鼠（对照）或OPN敲除母鼠（OPN敲除组）喂养野生型幼鼠，两组母鼠产奶量相当，野生型母鼠分泌的乳汁含高浓度OPN，而OPN敲除母鼠的乳汁则不含OPN。通过管饲法饲喂125I标记的母乳OPN，检测到幼鼠大脑中的放射性处于稳定水平，约占进食总OPN的1.7％，并在3 h内维持稳定读数，显示饮食中的OPN可以被吸收并转移到大脑。从出生第1天（D1）到D20每隔一天收集一次幼鼠脑样本，两组OPN mRNA表达相似，母乳OPN不会改变幼鼠大脑中OPN mRNA水平，但显著提高了D6和D8对照组幼鼠大脑OPN蛋白水平。OPN敲除组幼鼠记忆力和学习能力较野生型幼鼠弱。对照组幼鼠大脑髓鞘相关蛋白包括脑脊液髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）、髓磷脂相关糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）的表达增加，NG-2胶质细胞增殖和分化为少突胶质细胞并伴随着细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signal regulated kinase,ERK-1/2)和磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号转导的增加。综上所述，母乳OPN通过促进髓鞘形成在婴儿的大脑发育和行为发展中发挥重要作用。

 

　　3.母乳OPN的分析方法和含量

 

　　目前用于测量母乳OPN含量的方法多为ELISA，不同商业公司ELISA测量结果不尽相同。R&D Systems ELISA可用来测量来自脐带、3月龄婴儿、妊娠和非妊娠成人血浆样品中的OPN浓度；In-house human OPN ELISA是基于对母乳蛋白的多克隆抗体，并以纯化的母乳OPN为标准，新研制的专用于母乳OPN测定的ELISA；IBL ELISA尚未被验证可用于母乳OPN的测量。SCHACK等[12]采用上述3种ELISA测定同一批母乳样本（n=14）OPN含量，R&D Systems ELISA测定母乳OPN为（144±83)mg/L，与In-house ELISA测定值（122±70）mg/L无显著差异（P=0.45）；而IBL ELISA测得母乳OPN浓度为（1175±1137）mg/L，显著高于In-house ELISA测定值（P<0.01）。3组测定值具有良好的相关性（r2＞0.8）。

 

　　2004年NAGATOMO等[18]在日本福冈对20名健康母亲开展队列研究，酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA，Immuno-Biological Laboratories）检测结果显示母乳OPN浓度（中位数）随着婴儿月龄增大而变化，产后3～7天OPN含量最高达1493.4 mg/L，随后逐渐降低，产后1月为896.3 mg/L，产后4～7月为550.8 mg/L，至产后11～14月为412.7 mg/L。成熟乳（产后1个月）OPN水平远高于同期乳母血浆OPN水平（339.0 ng/mL）（P<0.001），并且母乳OPN含量与母亲血浆OPN含量呈正相关（r=0.627，P=0.047）。

 

　　2009年SCHACK等[12]对丹麦29名22～37岁母亲产后6～58天的母乳样品进行ELISA（Thermo Fisher Scientific）检测,得到母乳OPN浓度平均值为(138±79)mg/L。同时，测得3月龄婴儿及脐带血浆中OPN水平比成年人高7～10倍，高水平的母乳OPN和婴儿血浆OPN提示OPN可能对婴儿早期生长发育具有重要意义。

 

　　2015年，DALLAS等[28]收集到来自美国母亲分娩后2～58天内的母乳数据，包括8名足月分娩母亲的32个样本，以及14名早产母亲的28个样本。通过质谱分析峰值离子计数测量得到，早产乳和足月乳之间OPN水平差异没有统计学意义，但未报告母乳样品中OPN绝对水平。

 

　　2018年BRUUN等[2]进行的多中心研究显示，校正婴儿月龄和产妇年龄后，不同国家的母乳样品OPN含量（中位数）及其在总蛋白质中的占比差异有统计学意义（P＜0.01）（ELISA法检测，R&D Systems）。相较于丹麦（318人，产后3月OPN=99.7 mg/L），中国母乳中OPN水平（76人，产后30天266.2 mg/L）与韩国（117人，产后5周OPN=216.2 mg/L）、日本（118人，产后8周OPN=185.0 mg/L）更为接近。并且随着婴儿月龄的增加，哺乳期母乳OPN含量逐渐降低。

 

　　2019年Jiang等[21]对美国加州12名健康足月分娩母亲的随机临床试验结果也显示，ELISA法（R&D Systems）检测母乳OPN在初乳（产后1～7天）中含量很高（178±17.9）mg/L，到第9天（过渡乳8～14天）逐渐降低（134.8±18.5）mg/L，成熟乳OPN含量显著下降，分别为产后1月（65.8±13.7）mg/L、产后4月（48.8±12.0）mg/L、产后6月（55.9±13.8）mg/L、产后12月（48.3±10.2）mg/L。

 

　　4.结语

 

　　综上所述，母乳OPN高度磷酸化和糖基化，整蛋白分泌后常在靠近其整合素结合基序的区域被切割，以蛋白质水解后的片段形式存在。母乳OPN主要由乳腺上皮细胞和乳汁巨噬细胞/单核细胞分泌，不同商业ELIS A试剂盒测定OPN含量不尽相同，母乳OPN含量在不同地区也有差异，且随哺乳期的增加而逐渐降低。母乳OPN含量远高于牛乳及以牛乳为原料的配方奶粉。高浓度的母乳OPN在婴幼儿免疫系统建立、肠道发育以及认知发育过程中可能发挥重要作用。目前母乳OPN的研究尚处于起步阶段，亟待深入研究。

 

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